分子靶向诊疗I标记抗VEGFR

文章来源：中华核医学与分子影像杂志,,38(11):-.

作者：王任飞张瑞国张月倩谌红彬李宁张富海王汉杰常津张桂芝谭建

单位：　医院核医学科

引用本文：王任飞,张瑞国,张月倩,等.I标记抗VEGFR2靶向性纳米载体对未分化甲状腺癌的抑瘤作用[J].中华核医学与分子影像杂志,,38(11):-.DOI:10./cma.j.issn.-..11.

AntitumoreffectofI-labeledanti-VEGFR2targetednanoparticlesinanaplasticthyroidcarcinomamousemodels

WangRenfei,ZhangRuiguo,ZhangYueqian,ChenHongbin,LiNing,ZhangFuhai,WangHanjie,ChangJin,ZhangGuizhi,TanJian

CiteasChinJNuclMedMolImaging,,38(11):-.DOI:10./cma.j.issn.-..11.

摘要

目的

观察I－牛血清白蛋白(BSA)－介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)－抗血管内皮生长因子受体2(anti－VEGFR2)在未分化甲状腺癌(ATC)荷瘤裸鼠体内的靶向性分布及其抑瘤作用。

方法

构建I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2与I－BSA－MSNs。分别于人ATC细胞FRO荷瘤裸鼠瘤体内注射I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2(靶向组)、I－BSA－MSNs(非靶向组)、NaI(NaI组)和生理盐水(对照组)，通过SPECT/CT显像观察注射后不同时间荷瘤裸鼠体内的放射性分布，记录各组荷瘤裸鼠的体质量及肿瘤体积变化。采用两样本t检验和log－rank法分析数据。

结果

温育3h后，靶向组细胞荧光强度(.26±16.35)高于非靶向组(.61±9.65；t＝5.90，P0.05)。SPECT/CT显像示，注射后1～3周，靶向组肿瘤内放射性分布明显强于非靶向组(t值：7.～12.，均P0.05)。观察结束时，NaI组、对照组、非靶向组、靶向组的肿瘤体积分别增大至原来的(.3±19.3)%、(.6±24.2)%、(.7±13.2)%和(.7±6.2)%；前2组裸鼠体质量分别减少为原来的(88.6±3.0)%和(86.2±3.1)%，而后2组则增加至原来的(.1±3.1)%和(.2±3.4)%。生存分析曲线显示，靶向组的生存期(38d)明显高于非靶向组(34d;χ2＝8.05，P0.05)。

结论

I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2可有效抑制ATC的肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠生存期，在ATC的治疗和预后评估中有良好的应用前景。

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中未分化甲状腺癌(anaplasticthyroidcarcinoma，ATC)虽仅占2.0%左右，但其5年生存率低于10%,恶性程度比较高[1,2]。寻求新的治疗手段已成为目前ATC研究的热点和难点。在甲状腺细胞中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达与肿瘤形成密切相关，VEGF在ATC中呈过表达状态[3]。研究[3,4]证实，靶向VEGF受体(VEGFreceptor,VEGFR)的药物治疗已在ATC的治疗中取得成功。目前，多采用纳米载体内载抗肿瘤药物的靶向治疗模式，有研究[5]利用放射性核素64Cu标记纳米粒来进行ATC治疗，取得了良好效果。本研究应用I标记抗VEGFR2(anti－VEGFR2)的靶向性纳米载体，对ATC细胞株FRO进行相关体内及体外研究，评估其抑瘤作用。

材料与方法

1．细胞及主要试剂。ATC细胞株FRO为日本长崎大学山下俊一教授惠赠，将FRO细胞培养于含体积分数10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)和质量分数1%青霉素－链霉素的DMEM培养基中，在体积分数5%CO2和37℃的孵箱中培养。I由北京原子高科股份有限公司提供。DMEM高糖型培养基购自美国Invitrogen公司，FBS购自美国Gibco公司。Anti－VEGFR2抗体购自英国Abcam公司。牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、介孔二氧化硅纳米粒(mesoporoussilicananoparticles,MSNs)由天津大学材料学院常津教授的课题组提供，并据参考文献[6,7]制备BSA－MSNs－anti－VEGFR2和BSA－MSNs。

2．实验动物。BALB/c雌性裸鼠12只[无特殊病原体(specific－pathogenfree,SPF)级，4周龄，体质量15～20g；许可证号：SCXK(京)－]购自中国医学科学院北京协和医学院北京实验动物中心，饲养于天津医科大学实验动物中心无菌层流室中，温度22～25℃，相对湿度(55±5)%。

3．纳米粒结构表征。使用透射电子显微镜(日本JEOL公司JEOL－CXⅡ型)和动态光散射(dynamiclightscattering,DLS)对纳米粒的形态及粒径进行分析和测定。

4．FRO细胞对纳米载体的摄取。将2种荧光标记的纳米载体(BSA－MSNs－anti－VEGFR2和BSA－MSNs)分别加入到铺满FRO细胞的共聚焦小皿内，分别培养0.5和3h后，用质量分数4%多聚甲醛固定细胞，4′，6－二脒基－2－苯基吲哚(4′，6－diamidino－2－phenylindole,DAPI)染色，在激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司FV型)下观察2种纳米载体在FRO细胞中的富集情况。

5．I标记纳米载体。采用氯胺T标记法[8]。取50μl(10mg/ml)纳米载体加入50μl(5mg/ml)的氯胺T及37MBq新鲜NaI溶液，反应60s，加入50μl(5mg/ml)偏重亚硫酸钠终止反应。测定混合物的放射性活度后，以r/min离心8min(离心半径5cm)，重复3次以提纯标记物。测定终产物I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2和I－BSA－MSNs的标记率及放化纯。

6．荷瘤裸鼠模型建立、显像及疗效观察。将已调整好密度的FRO细胞悬液接种于裸鼠右肩，每只裸鼠接种约5×个细胞。当肿瘤直径长至10mm左右时，将其分为4组(每组3只)：NaI组(瘤内注射74MBqNaI)、非靶向组(瘤内注射74MBqI－BSA－MSNs)、靶向组(瘤内注射74MBqI－BSA－MSNs－anti－VEGFR2)和对照组(瘤内注射50μl生理盐水)，前3组分别在给药后1、2、3、7、14和21d行SPECT/CT(美国GE公司DiscoveryNM/CT)显像。每次显像结束后，勾画肿瘤感兴趣区(regionofinterest,ROI)，像素大小设定为9，面积为75mm2，并记录ROI内的平均计数。实验前1d，每只裸鼠腹腔内注射无菌过氯酸钾溶液1ml(1mg/ml)，并于裸鼠饮用水中加入1mg/ml的过氯酸钾。

疗效观察：每隔3d分别测量4组瘤体大小及裸鼠体质量，并计算肿瘤体积。治疗结束时，取对照组裸鼠肿瘤组织行VEGFR2免疫组织化学检查。

7．统计学处理。采用GraphPadPrism6.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以±s表示。组间比较采用两样本t检验、单因素方差分析和最小显著差异t检验；采用log－rank法对不同组间生存率进行比较，以P0.05为差异有统计学意义。

结　果

1．纳米粒的结构表征。透射电子显微镜显示纳米粒为球形，DLS测得MSNs、BSA－MSNs和BSA－MSNs－anti－VEGFR2的平均直径分别为、和mm，Zeta平均电位分别为－23.91、45.53和28.45mV。

2．FRO细胞对纳米载体的摄取。共聚焦显微镜下FRO细胞对非靶向和靶向纳米载体的摄取情况如图1所示。温育0.5h后，FRO细胞即对这2种纳米载体有明显摄取，荧光信号主要集中在胞质中；温育3h后，2组细胞内的荧光信号均较0.5h时更强，且靶向纳米载体组细胞内的荧光强度高于非靶向组(.26±16.35与.61±9.65；t＝5.90，P0.05)。I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2和I－BSA－MSNs的标记率为50%～75%，放化纯为95%～98%。

图1FRO细胞对纳米载体摄取情况的共聚焦显微镜检测结果[左为异硫氰酸荧光素(FITC)染色，右为融合]。A、B分别为注射后0.5h时细胞对牛血清白蛋白(BSA)－介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)和BSA－MSNs－抗血管内皮生长因子受体2(anti－VEGFR2)的摄取情况；C、D分别为3h时细胞对两者的摄取情况

3．体内显像。3组荷瘤裸鼠在瘤内注药后不同观察时间的SPECT/CT显像结果见图2，2组纳米载体荷瘤裸鼠肿瘤组织放射性计数见表1。注药后放射性药物主要分布在肿瘤部位，其他部位未见明显放射性分布。NaI组肿瘤部位放射性在注药后2d快速清除，第3天时瘤体部位已无明显放射性分布；注药后1～3周，靶向组瘤体内放射性分布均明显强于非靶向组(t值：7.～12.，均P0.05)。

图2荷未分化甲状腺癌(ATC)裸鼠瘤内注射不同药物后不同时间点的SPECT/CT图像。A.I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2组；B.NaI组；2C.I－BSA－MSNs组

4．疗效观察。以注药前的肿瘤体积(V)/裸鼠体质量(m)为基准，注药后各组荷瘤裸鼠在不同观察时间的V和m见图3。当荷瘤裸鼠死亡或出现精神症状或体质量下降超过20%时，观察结束。除了靶向组，其余3组肿瘤体积均逐渐增大。24d(观察结束)时，NaI组和对照组的肿瘤体积分别增大到原来的(.3±19.3)%和(.6±24.2)%；在30d时，非靶向组的体积增加至原来的(.7±13.2)%，与NaI组和对照组相比，体积增加幅度明显缩小(t值：5.89，6.15，均P0.05)。注药后9d，靶向组的肿瘤体积开始逐渐缩小，且在观察期结束(30d)时，体积约为初始体积的(.7±6.2)%。此外，在观察期内，NaI组和对照组荷瘤裸鼠的体质量逐渐下降，至观察结束，2组荷瘤裸鼠的体质量分别为初始值的(88.6±3.0)%和(86.2±3.1)%；而靶向组和非靶向组荷瘤裸鼠体质量在注药后1周逐渐增加，治疗后30d分别增加至原来的(.2±3.4)%和(.1±3.1)%，与NaI组和对照组相比，体质量变化差异均有统计学意义(F＝14.95，t值：5.4～11.3，均P0.05)。

图3治疗后不同时间4组FRO荷瘤裸鼠肿瘤体积(A)及体质量(B)的变化曲线。靶向组为向FRO荷瘤裸鼠瘤体内注入74MBq的I－牛血清白蛋白(BSA)－介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)－抗血管内皮生长因子受体2(anti－VEGFR2)，非靶向组为向FRO荷瘤裸鼠瘤体内注入74MBq的I－BSA－MSNs；NaI组与对照组为注射74MBqNaI和50μl生理盐水

5．生存分析及肿瘤免疫组织化学检查结果。由图4可知，对照组和NaI组荷瘤裸鼠的中位生存期分别为25和27d；非靶向组的中位生存期为34d，较NaI组和对照组明显延长(χ2值：9.84和8.45，均P0.05)。靶向组的中位生存期为38d，较非靶向组延长(χ2＝8.05，P0.05)。对照组荷瘤裸鼠免疫组织化学检查结果显示，肿瘤组织VEGFR2明显高表达。

图44组FRO荷瘤裸鼠治疗后的生存率比较

讨　论

ATC恶性度很高，患者中位生存期仅约5个月，目前尚无有效的治疗方法，确诊后仅20%的患者生存期超过1年[2]。VEGF是主要的新生血管刺激因子，其与细胞表面的受体结合，通过旁分泌和自分泌的方式来促进血管生成，进而导致肿瘤生长、侵袭和转移。已有研究[9,10]证实anti－VEGFR靶向药可以提高包括ATC在内的许多癌症的生存期。Gule等[11]的研究表明，使用表皮生长因子受体和VEGFR2的共同拮抗剂凡德他尼可显著抑制ATC肿瘤的生长。本研究亦证实，anti－VEGFR2靶向组可更有效地抑制裸鼠ATC肿瘤的生长，进而明显延长其生存期。

MSNs是一类无机纳米粒，易被肿瘤细胞摄取，具有良好的生物相容性，且结构稳定、易修饰，具有低毒性及高效性等优点[12]。Goel等[6]证实，用VEGF靶向、内载anti－VEGFR药物的MSNs治疗模式可有效减少血管形成并抑制人胶质细胞瘤的生长。本研究选用I标记MSNs，同时利用anti－VEGFR2的靶向性来治疗ATC，取得了满意的效果。这表明，MSNs在内载靶向药物、靶向基团修饰及放射性核素标记方面具有良好的发展前景。

SPECT/CT能提供病变组织的解剖及功能状态信息，能在注药后的不同时间动态监测放射性药物的组织分布及代谢活性[13,14]。Ming等[15]利用I标记的纳米脂质体对非小细胞肺癌荷瘤裸鼠进行SPECT/CT显像，发现给药后21d，精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp,RGD)靶向纳米载体组肿瘤内信号强度明显强于非靶向组。本研究也在不同时间对ATC荷瘤裸鼠行SPECT/CT显像，注药后3dNaI组放射性基本消失；注药后2周靶向组和非靶向组均有明显放射性分布；注药后3周，靶向组放射性信号明显强于非靶向组。由此可见，MSNs纳米载体经anti－VEGFR2修饰后其在瘤体中的滞留时间得以延长，此与既往研究[6]结果类似。

I可特异性聚集在甲状腺癌病灶处并发射β射线，故在分化型甲状腺癌的治疗中起重要作用[16]。用于裸鼠肿瘤的I治疗剂量不尽相同，有采用MBq的研究[17]；也有用55.5MBq取得满意结果的研究[18]。本研究中的裸鼠瘤内注射剂量为74MBq，注药后1周，I标记纳米载体组的裸鼠体质量逐渐增加，其中靶向组更为明显；与非靶向组相比，NaI组和对照组的瘤体体积增长较为迅速。值得注意的是，注药后9d，靶向组肿瘤体积开始逐渐缩小，这一变化与裸鼠的体质量变化恰好相反。此外，本研究发现，靶向组荷瘤裸鼠的中位生存期为38d，较非靶向组(34d)及NaI组(27d)明显延长。由此可见，anti－VEGFR2修饰可有效抑制肿瘤生长，提高I治疗的效果，从而延长荷瘤裸鼠生存期。

综上，I－BSA－MSNs－anti－VEGFR2作为一种靶向性放射性药物，其在靶组织中的滞留时间长，能更有效地发挥抑瘤作用，显著延长荷瘤裸鼠生存期。该研究结果对甲状腺癌(尤其是低分化、未分化或治疗过程中逐渐失分化的甲状腺癌)的临床治疗有着积极的借鉴意义。

利益冲突

MarottaV,SciammarellaC,CapassoM,etal.PreliminarydataofVEGF－AandVEGFR－2polymorphismsaspredictivefactorsofradiologicalresponseandclinicalout